实验前的准备工作是实施免疫细胞分离的重要步骤。在此，我们将介绍如何配制40%和80%的Percoll溶液。对于40% Percoll溶液，我们将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，制备出等渗的100% Percoll母液。随后，将100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS以4:6的比例混合，最终得到40%等渗Percoll溶液。类似地，80% Percoll溶液的制备方法相同，只是与RPMI1640/1×PBS的配比调整为8:2。

在肠道固有层免疫细胞的分离步骤中，首先使用颈椎脱臼法将小鼠处死并固定，随后用75%酒精消毒鼠腹部，并在正中纵向切开腹腔。接下来，在小鼠胃与十二指肠的连接处剪断，分离小肠周围的脂肪组织与肠系膜后，取出小肠，再在小肠与盲肠的连接处剪断，以完成小肠的分离。

将分离的小肠放入含有5mL 4°C预冷PBS的10cm培养皿中，利用镊子和剪刀去除脂肪组织和派伊尔结。派伊尔结是小鼠肠道黏膜免疫系统的重要组成部分，其去除可确保获得更纯净、更具代表性的目标细胞群体，有助于提高实验结果的可靠性。

随后，将小肠切成四段，纵向剪开以暴露肠内容物，并轻轻刮除粘膜表面的肠内容物。然后将小肠转移至含有10mL HBSS+2% FBS的50mL离心管中，剧烈涡旋10-20秒，重复清洗两次。接着，将清洗过的肠组织剪碎成0.5cm的小段，转移至2mL圆底管中，并加入1mL小鼠肠道组织解离液，在37°C的水平摇床上孵育60分钟。

经过孵育后，通过70μm细胞筛网过滤处理后的肠组织，随后使用PBS冲洗细胞筛网，得到的细胞滤液将置于50mL管中进行离心。在离心完成后，吸取中间的白膜层免疫细胞至新的15mL离心管中，反复使用PBS清洗，以获得肠道固有层淋巴细胞。

最后，使用细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至5-10×10⁶ cells/mL，将细胞悬液分配于流式管中，准备进行后续实验操作。所有操作均需注意保持细胞成分的完整性，以确保实验高效且可靠。

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