将动物体内的各类组织提取出来，经过不同的酶（如胰蛋白酶）、螯合剂（如EDTA）或机械处理，分散为单个细胞，并置于适宜的培养基中进行培养，以保证细胞的存活、生长与繁殖，这一过程称为原代细胞培养。原代细胞培养的主要步骤包括取材、分离与培养和维持。本文将重点讨论原代细胞的取材和分离方法。

一、取材

动物或人类细胞的取材是成功开展原代细胞培养的首要条件，直接影响细胞的体外培养效果。取材的基本要求包括：

• 取材必须新鲜并确保保鲜。
• 应严格无菌操作。
• 避免产生机械损伤。
• 清除无用组织并避免干燥。
• 注意组织类型、分化程度及年龄等因素。
• 做好详细记录。

各类组织的取材技术

以下是不同类型组织的取材方法：

• 皮肤和粘膜：取材通常来自手术过程中切除的皮片，通常面积为2-4平方厘米。
• 内脏和实体瘤：除消化道外的内脏通常是无菌的，取材时需明确待取组织的类型及部位，注意避开坏死或液化的区域。
• 血液细胞：通常从静脉外周血抽取，或从淋巴组织如脾、扁桃体等处分离细胞，此时需注意抗凝处理。
• 骨髓、羊水：取材时需严格无菌并快速分离，使用不含钙、镁的PBS进行清洗。
• 鼠胚组织：采用人道方法处死孕期适合的动物，进行无菌解剖以获取胚胎。
• 幼鼠胚肾：用无菌方法切开及固定以获取肾脏。
• 鸟类胚胎：选择适龄胚蛋，用无菌方法打开获取胚胎组织。

二、原代细胞的分离

由于人或动物体内细胞结合较为紧密，直接在体外培养难度较大，因此需要将组织块充分分散以单独获得细胞。

1. 悬浮细胞的分离方法

如果组织材料来自血液或体液，最简单的方法是使用低速离心（如1000r/min）进行分层，便于收集目的细胞。

2. 实体组织材料的分离方法

对于实体组织，由于细胞间紧密结合，可采用以下方法使细胞充分散开：

• 机械分散法：简便快速，但可能对组织造成机械损伤，适合处理纤维成分少的软组织。
• 消化分离法：通过酶的作用使细胞间的结合结构松动，并最终形成细胞悬液。

酶消化分离法

常用的消化酶包括胰蛋白酶和胶原酶，它们能有效分散细胞，适合于各种组织的消化。此外，也可使用其他消化酶如链霉蛋白酶、粘蛋白酶等。

非酶消化法

EDTA作为非酶消化物，有助于与细胞内的钙、镁离子结合，从而促进细胞的脱离与分散。

消化分离法的操作步骤

消化分离法的步骤包括剪切、加液、漂洗、消化和弃去消化液，最后进行机械分散。

注意事项

在消化过程中，应多次漂洗以去除抑制酶活性的物质。此外，胰蛋白酶的浓度和作用时间需要严格控制，以避免对细胞造成毒性影响。

综上所述，通过合理的取材和分离方法，可以有效帮助实现高质量的尊龙凯时原代细胞培养，促进生物医学研究的发展。